蛋白质间相互作用是构建细胞功能图谱的核心环节。共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）作为研究蛋白互作经典技术，因其操作简便、结果直观而被广泛使用。随着分子生物学技术的发展，绿色荧光蛋白（GFP）标签在蛋白功能研究中的应用逐渐普及，GFP-tag Co-IP成为一种兼具高特异性和低背景的蛋白互作研究方法。

一、GFP标签共免疫沉淀的原理与优势

1、技术原理概览

GFP标签共免疫沉淀通过将目标蛋白与GFP融合表达（例如GFP-X），利用高亲和力的抗GFP抗体（尤其是GFP-Trap单域抗体）选择性拉下融合蛋白，并同步捕获其天然结合的互作蛋白复合物。该方法依赖的是蛋白质在细胞内的天然相互作用，不会引入额外干扰，适合研究生理条件下的蛋白互作。

2、GFP标签的独特优势

（1）无需特异性抗体：相比HA、Myc等小标签，GFP融合蛋白可直接通过荧光确认表达，无需对每个互作蛋白都制备抗体，降低共免疫沉淀实验门槛。

（2）荧光可视化：GFP具备内在荧光，可用于验证表达定位和细胞内分布，辅以共定位实验提高互作可靠性。

（3）高亲和力富集：GFP-Trap纳米抗体亲和力极高（低至皮摩尔级），能在复杂背景中有效富集目标复合物，显著提升下游分析灵敏度。

（4）通用性强：适用于多种细胞系与实验条件，便于在哺乳动物、酵母或植物系统中推广使用。

二、实验流程详解

1、构建GFP融合表达载体

实验的第一步是将目的蛋白克隆至表达载体中，使其与GFP标签融合表达。常用载体如pEGFP-N1、pEGFP-C1等，需根据蛋白结构与功能选择在N端或C端融合，确保不干扰其活性或亚细胞定位，是构建GFP标签共免疫沉淀体系的基础。

2、转染并表达融合蛋白

选择适合的细胞系（如HEK293T、HeLa等）进行瞬时或稳定表达。通常表达24–48小时即可达到较好效果。可通过荧光显微镜实时监测GFP信号，评估表达效率和定位正确性。

3、温和裂解细胞，保留互作复合物

使用非变性裂解缓冲液（例如含有1% NP-40或0.5% Triton X-100的缓冲体系），在4°C条件下缓慢裂解细胞，最大程度保留蛋白互作结构。必须添加蛋白酶抑制剂（如PMSF和Protease Inhibitor Cocktail），防止降解干扰分析结果。

4、使用GFP-Trap磁珠进行免疫沉淀

将裂解液与预先洗涤的GFP-Trap磁珠混合，旋转孵育1–2小时，利用其对GFP的高亲和性特异捕获融合蛋白及其互作伴侣。随后需进行3–5次洗涤以去除非特异性结合蛋白。洗涤缓冲液可适当加入低浓度去污剂（如0.05% Tween-20）以提高共免疫沉淀特异性。

5、下游检测分析

（1）Western blot：用于验证候选互作蛋白是否共沉淀，适合验证已知互作关系。

（2）质谱分析（LC-MS/MS）：适用于筛选未知互作蛋白，构建系统互作网络，是目前蛋白互作研究的主流方法。

（3）显微共定位实验：与免疫荧光联合，辅助判断互作蛋白的空间共存关系，提升生物学解释力。

三、实验优化要点与常见问题解决

为了确保实验成功与数据可靠性，以下几个方面尤为关键：

1、提高蛋白表达效率

若GFP融合蛋白表达量偏低，可尝试优化转染条件（如使用脂质体或电转方式）、更换表达载体或选用高表达细胞系。同时需确认蛋白未因融合标签而发生降解，避免影响共免疫沉淀效率。

2、降低背景杂带

高背景常源于非特异性结合。优化措施包括增加洗涤次数、延长洗涤时间，或在裂解及洗涤缓冲液中加入适量盐和非离子型去污剂（如Tween-20、NP-40）以削弱弱亲和结合。

3、捕获效率不理想

应评估融合位置是否影响了蛋白折叠或互作界面。例如若N端GFP影响蛋白功能，可尝试将标签移至C端。此外也可通过Western blot确认GFP标签是否完整表达。

4、避免蛋白降解

全程保持低温操作（4°C），并加入抑制剂组合是防止降解的关键。样品处理时间应尽量压缩，避免长时间放置，是确保共免疫沉淀样品质量的核心策略。

四、GFP-tag Co-IP结合质谱：解锁互作组学全景视角

GFP标签共免疫沉淀结合质谱（Co-IP/MS）具备更强的信息输出能力，能在单次实验中同时解析数百种蛋白的相互作用，尤其适用于未知信号通路、新蛋白功能注释等探索性研究。

在百泰派克生物科技的蛋白互作组学平台中，我们使用高分辨Orbitrap Exploris 480质谱系统，结合精准的数据库比对与网络分析，输出包括：

• 高可信度蛋白互作谱（含FDR过滤）
• GO/KEGG功能注释与通路富集分析
• Cytoscape网络构建与核心互作节点识别
• 与公开互作数据库（如STRING）比对验证，提升研究说服力

这一策略已成功应用于多个课题项目中，如癌症信号调控、病毒-宿主互作、新型药靶筛选等。

GFP标签共免疫沉淀是一种灵敏、特异且适应性强的蛋白互作研究工具。尤其当其与质谱技术、网络分析手段相结合时，便能构建出蛋白复合物之间的全景关系图，为揭示复杂生物学机制提供强有力的数据支持。百泰派克生物科技专注于蛋白互作组学研究，依托先进质谱平台与标准化实验流程，助力科研人员从分子层面洞察生命现象。如果您正在进行互作蛋白筛选、通路研究或蛋白功能注释，欢迎联系我们获取定制化技术支持与数据分析服务。

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百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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