腺相关载体（AAV）是一种广泛用于基因治疗和疫苗开发的病毒载体，其在基因转移方面表现出色，且具有低致病性和广谱感染性的特点。腺相关载体的制备、纯化与表征作为基因治疗和生物医学研究的关键环节，直接影响到载体的质量和功能。腺相关载体的制备、纯化与表征的应用广泛，其不仅在基因治疗中扮演着关键角色，还在疫苗开发、遗传疾病研究以及癌症治疗策略中展现出巨大潜力。例如，在治疗遗传性视网膜疾病中，AAV载体已经被成功用于递送功能性基因，从而恢复视力功能。此外，AAV载体在神经退行性疾病和肌肉营养不良症的研究中也显示出良好的应用前景。

一、制备

在腺相关载体的制备过程中，研究人员通常利用重组DNA技术，通过细胞培养系统生成具有特定基因插入片段的AAV颗粒。制备期间，选择合适的宿主细胞及优化培养条件是确保高效合成和收获病毒颗粒的重要环节。

1、细胞系选择

常用的细胞系有 HEK293 细胞等，该细胞系易于培养且能高效支持 AAV 的生产。

2、载体构建

将目的基因插入到 AAV 的基因组中，构建成重组 AAV 载体质粒。同时需要辅助质粒，如包含腺病毒辅助基因（E2A、E4、VA 等）和 AAV 的 rep/cap 基因的质粒，为 AAV 的复制和包装提供必要的元件。

3、转染

采用脂质体转染法、磷酸钙转染法或电穿孔法等，将重组 AAV 载体质粒和辅助质粒共转染到宿主细胞中。在细胞内，重组载体在辅助质粒和细胞内环境的作用下进行复制和包装，形成具有感染能力的 AAV 颗粒。

4、培养与收获

转染后的细胞在合适的培养基中培养，一般培养 3-5 天，待细胞出现明显的病变效应后，收集细胞及细胞培养上清液，其中即含有制备好的 AAV 载体。

二、纯化

在纯化腺相关载体中，常用技术包括PEG沉淀、柱层析和超速离心等。这些方法旨在去除杂质和未封装的DNA，同时保留病毒颗粒的完整性和功能。纯化过程中需要密切监控病毒的浓度和纯度，以确保其符合下游应用的标准。

1、粗提

首先采用低速离心去除细胞碎片等较大的杂质，然后可以通过超滤或透析等方法进行浓缩，得到 AAV 的粗提物。

2、层析纯化

（1）离子交换层析：利用 AAV 颗粒表面的电荷特性，通过离子交换树脂进行分离。在合适的缓冲液条件下，AAV 与树脂结合，然后通过改变缓冲液的离子强度等条件将其洗脱下来，达到纯化的目的。

（2）亲和层析：利用 AAV 与特定配体的特异性结合作用进行纯化，如使用肝素亲和层析，AAV 可与肝素特异性结合，再通过洗脱得到高纯度的 AAV。

（3）凝胶过滤层析：根据 AAV 颗粒的大小，通过凝胶过滤介质进行分离。AAV 颗粒在凝胶柱中根据其大小不同而以不同的速度通过，从而与其他杂质分离，获得纯化的 AAV。

3、密度梯度离心

常用氯化铯（CsCl）密度梯度离心，将 AAV 粗提物加入到 CsCl 密度梯度溶液中，在超速离心的作用下，AAV 颗粒根据其密度在梯度中形成特定的条带，与其他杂质分离。收集含有 AAV 的条带，即可得到高纯度的 AAV 载体。

三、表征

表征是腺相关载体研究的最后一步，目的是评估病毒颗粒的物理化学性质、基因装载效率和生物活性。常用的表征方法包括电子显微镜观察、荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验等。这些技术为腺相关载体的质量控制提供了科学依据，确保其在基因治疗中的安全性和有效性。

1、物理性质表征

（1）颗粒形态：采用透射电子显微镜（TEM）观察 AAV 颗粒的形态和大小，AAV 颗粒呈二十面体对称结构，直径约为 20-25nm。

（2）粒径分布：动态光散射（DLS）技术可用于测量 AAV 颗粒的粒径分布，了解其均一性。

2、基因组分析

（1）滴度测定：常用的方法有实时定量 PCR（qPCR）、终点稀释法等。qPCR 通过检测 AAV 基因组中的特定序列，计算出每毫升样品中的病毒基因组拷贝数，即病毒滴度。

（2）序列验证：采用 PCR 扩增 AAV 载体中的目的基因序列，然后进行测序，与预期的序列进行比对，确保目的基因序列的准确性和完整性。

3、生物学活性表征

（1）感染活性测定：将 AAV 载体感染相应的靶细胞，通过检测报告基因的表达情况，如绿色荧光蛋白（GFP）的表达，或通过检测目的基因的表达水平，来评估 AAV 载体的感染活性和转导效率。

（2）免疫原性评估：在动物模型中，检测 AAV 载体引起的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫。通过检测血清中的抗体水平、淋巴细胞的增殖反应等，评估 AAV 载体的免疫原性。

百泰派克生物科技专注于提供腺相关载体的制备、纯化与表征服务。我们利用先进的技术平台和丰富的经验，确保提供高质量的AAV载体，满足客户在基因治疗和疫苗开发中的不同需求。无论是小规模的研究型生产还是大规模的临床产品制备，我们都能根据客户的特定要求提供量身定制的解决方案。通过与百泰派克生物科技合作，您将获得可靠的技术支持和高效的项目推进，助力科研成果的快速转化。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

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