3D细胞培养：您的酶标仪准备好了吗？
一直以来，传统的2D细胞培养广泛用于细胞生物学研究和药物开发，为研究细胞通路提供了方便的体外模型。然而，细胞在平面上生长，这与天然环境并不相同，也导致细胞行为有明显差异。形态、增殖、基因表达、代谢和活力发生显著变化，这会影响细胞对药物的反应。因此，许多临床前研究认为2D细胞培养技术是不够的，它意味着仍需要在动物模型中开展大量的实验，而这一过程有难度，耗时又昂贵。
一些实验室开始采用3D细胞培养技术，来帮助缩小2D体外研究和动物模型之间的差距。尽管3D细胞培养不是最近的发明，早在1907年人们就用于培养青蛙神经元，但在过去的十年中，对细胞分析的生物相关性的追求促使各种新颖的3D培养技术快速发展。
这些3D培养技术可大致分为两类：需要支架和不需要支架。它们旨在为细胞生长、增殖和分化提供了一个更类似于体内的环境。许多被设计成方便的微孔板形式，让细胞培养的过程完全自动化，这带来了中等通量的重复3D培养。不过，实验室中现有的酶标仪大多是为2D培养而设计的，它们是否能让您实现3D细胞分析的好处，您又如何最有效地利用这些仪器呢？下面我们来听听Tecan奥地利公司市场部经理Michael Fejtl的看法。
读取模式
对于所有的细胞应用而言，光学元件位于微孔板底部的酶标仪至关重要，因为培养基的量及光学性质对自上而下的测定会有明显的影响，导致重复性差和数据丢失。这对3D细胞培养尤为重要，因为视野深度增加。在理想的情况下，仪器应当有一个可调节的Z轴聚焦，让用户优化孔内高度，实现灵敏度最大化。一些系统提供全自动的Z轴聚焦，通过参考孔或多个孔的预扫描来确定最佳的Z轴位置。
激发孔径的大小也很重要；最理想的情况是，激发光源涵盖整个培养物。这样就不必在每个孔中的不同点进行多次测定，取平均结果，而一些3D细胞培养技术就是专为满足此需求而开发的。
在发射端，3D细胞培养也有几个需要注意的地方。基于支架的3D细胞培养方法可能会存在高的背景荧光，这是因为支架材料的自发荧光；有必要进行一些形式的背景校正，以避免遮盖细胞反应的微妙变化。而大的动态范围也很重要，因为每孔中更高浓度的细胞会很容易导致整个样本出现大的信号变化。
对于某些应用，可能需要测定多个分析物，因此必须确保酶标仪的光学元件为每个分析物带来精确的激发和发射，且滤光片组合适当，以避免信号的交叉。
环境控制
严格的环境控制对于任何细胞应用而言非常重要，即使是小的变化也往往导致实验偏差或错误的结果。尽管大多数酶标仪提供某种形式的温度控制，但我们必须了解这是如何实现的。很多系统的恒温控制不太好，随着时间的变化会出现大的温度波动，因为系统对温度测量室中温度的升高或降低反应太慢。加热元件的位置也会影响各孔之间的性能。不均匀的加热会引起微孔板的温度梯度，影响细胞生长和酶活。对于长期的研究，这还可能导致各孔之间的蒸发速率不同，这会显著影响分析性能。
3D细胞培养的主要目标之一是让细胞分析带来更好的生物相关性，而维持与体内相似的CO2和O2分压很关键，尤其是对于真核细胞。这些细胞系的增殖和存活严格依赖于培养基条件；培养基的pH通常是由碳酸氢盐缓冲液来维持的，并通过空气中CO2分压的精确调节来稳定缓冲液系统。此外，在体内发现的缺氧环境可能对药物吸收和代谢有显著影响，这让O2分压的精确调节变得同样重要；在研究肿瘤细胞中缺氧诱导的转录因子时，这特别有用。
然而，目前市场上大部分的酶标仪都缺乏控制CO2和O2的能力，需要将微孔板在培养箱和酶标仪之间移来移去。尽管这能够实现，但并不理想。最理想的情况当然是，酶标仪能够提供CO2和O2的精确调节，实现连续的测定。
结语
3D细胞培养系统代表了细胞分析的一次真正进步，提供了更高的生物相关性，节省了下游实验的费用。3D培养的开展需要您彻底了解酶标仪的软件和硬件结构，仔细检查仪器参数与培养和分析的要求是否匹配。若酶标仪能够实现分析的完全自动化，在测量室中长期连续地测定细胞反应，那当然是最理想的。（生物通 薄荷）
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