什么是rhPCR？

rhPCR（RNase H-dependent PCR）即依赖于RNase HII的PCR，在PCR的基础上增加了RNase HII和封闭式可切割rhPCR引物。rhPCR利用了RNase HII的特殊性质，即可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA，但不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，不能消化单链或双链DNA或RNA。因此只有当互补靶DNA碱基存在时，RNase HII才能消化DNA-RNA杂交链从而允许引物延伸。由于仅在与互补靶序列紧密结合时才发生rhPCR引物的裂解切割，故极大地提高了反应的准确性。rhPCR因其特异性和灵敏度，在单核苷酸多态性（SNP）、基因分型、多靶标同时检测、环境核酸检测等方面具有一定的优势。

技术路线

01

引物设计

引物设计要确保切割后熔化温度高于退火温度，以保证引物在PCR循环中稳定结合模板，rhPCR引物由3个部分构成：

1） 5' DNA片段：在长度和熔化温度（Tm）要求上与标准PCR引物相当，经过RNase HII酶的切割后，能够与模板DNA有效配对并进行延伸。

2） 单个RNA碱基，为RNase-HII提供切割位点。

3） 3' DNA片段：带有一个阻断剂的四或五个碱基长度，通常是一个短的，不可延伸的分子，例如丙二醇，可以阻止DNA聚合酶的延伸，直到该阻断被移除。

02

切割与延伸

在rhPCR反应开始时，引物和模板DNA是游离的。当引物与特定的RNA:DNA异源双链模板结合后，封闭引物的RNA 碱基5'-侧被RNase HⅡ酶识别并切割，留下一个带有3'-羟基的DNA寡核苷酸，为DNA聚合酶提供延伸的起点。

图1. rhPCR原理图[1]

翌圣RNase HⅡ

翌圣的RNase HⅡ（Cat#14539）来源于深渊热球菌 (Pyrococcus abyssi, P.a.)，无核酸外切酶、切口酶、RNase残留，低宿主残留，有效减少体系假阳性。翌圣RNase HⅡ极度耐热，95°C反应30 min后，仍保持活性，可与rhPCR各反应体系兼容，也适用于LAMP等。

01

E. coli基因组DNA残留< 0.5 copies/100 U

对不同批次的RNase HⅡ进行E. coli基因组DNA残留检测，结果显示翌圣RNase HⅡ宿主基因组DNA残留远低于0.5 copies/100 U。

图2. E. coli基因组DNA残留检测

02

95℃耐热性测试

对翌圣RNase HⅡ进行95℃加热0~45 min后，测试RNase HⅡ的酶活结果，结果表明翌圣RNase HⅡ加热45 min后，酶活几乎没有损失。

图3. 95℃耐热测试

03

无核酸外切酶、切口酶、RNase残留（1 U投入量）

将1 U 不同批次的RNase HⅡ分别与相应的底物DNA/RNA在37℃孵育4 h，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，RNase HⅡ无核酸外切酶、切口酶、RNase残留。

图4. 核酸外切酶、切口酶、RNase残留检测结果

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