IF=15.328：浙大医学院刘伟/Dante Neculai团队合作揭示脂质转移蛋白ORP8在脂滴自噬中的关键作用
脂质自噬是自噬小体选择性吞噬脂滴( LDs )进行溶酶体降解，对脂质和能量稳态至关重要。自噬体对细胞器或蛋白质聚集体的选择性吞噬需要吞噬体相关的LC3/GABARAP蛋白直接与特定的细胞器受体相互作用，或与细胞器相关的连接蛋白结合。目前已经发现许多类似受体可以指导线粒体、内质网(ER)和核糖体的包封。然而，特异性介导LDs识别和包裹的蛋白仍有待确定。
2022年12月，浙江大学医学院刘伟教授研究团队与Dante Neculai团队合作在Protein & Cell（IF=15.328）上在线发表题为ORP8 acts as a lipophagy receptor to mediate lipid droplet turnover 的论文，研究发现脂质转移蛋白ORP8是特异性的脂质自噬受体，通过能量感受激酶AMPK调节与LC3 / GABARAPs的相互作用介导脂滴（LDs）的自噬识别和降解，这些发现可能为脂代谢相关疾病的干预和治疗提供新的靶点。
病毒产品 AAV9-ORP8-WT AAV9-ORP8-T54A/S65A AAV9-ORP8-LIRs-6A AAV9- ORP5 实验动物 8周龄ob/ob小鼠 注射方式 腹腔注射 注射剂量 10E12VG 感染时间 4周
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1、ORP8促进LD降解
作者通过研究发现ORP8定位于LDs，且在诱导噬脂的条件下，ORP8的定位会增加。过表达ORP8会减少前脂肪细胞、小鼠肝脏和血浆中的甘油三酯（TGs），因此，作者进一步评估了ORP8在LD代谢中的潜在作用。敲低ORP8 而非ORP5 可显著增加血清饥饿细胞的LD含量，随后利用CRISPR-Cas9系统构建了ORP8敲除的Hela细胞，KO细胞给予OA治疗或血清饥饿，通过测定LD标记物PLIN2和TG水平发现ORP8负向调节LD代谢。接下来，作者阻断了LD的生物发生，分析ORP8-KO细胞中LD的降解，发现ORP8促进了LD的降解，而不依赖于脂肪分解。
图1.ORP8促进LD降解 
2、ORP8可调节脂质自噬
作者进一步发现ORP8可以调节脂质自噬，ORP8在脂质自噬中的功能及其与LC3的相互作用强烈提示LD定位的ORP8可能作为靶向LD到自噬体的受体。为了验证并阐明ORP8的功能机制，作者从OA处理的细胞中纯化了LD，正如预期的那样，膜结合LC3-II在WT细胞的LD上大量存在，但在ORP8-KO细胞的LD中含量极低。体外LD膜结合试验发现，GFP-LC3招募了WT细胞的LD，而不是ORP8-KO细胞。进一步研究发现ORP8和LC3之间的相互作用，发现LD定位的ORP8与膜相关的LC3 / GABARAP直接发生相互作用，且该过程是吞噬体靶向LDs所必需的。
图2.ORP8-LC3相互作用的特征
3、AMPK磷酸化并激活ORP8
AMPK激活非选择性自噬响应能量缺乏，既往研究提示AMPK参与了脂质自噬，可能与其启动自噬泡形成有关，此外，研究发现长链脂肪酸的辅酶A酯可变构激活肝细胞中主要表达的含β1亚基的AMPK。因此，作者研究了AMPK在ORP8介导的脂质自噬中的潜在作用。OA治疗和血清饥饿都能激活HeLa细胞中的AMPK，有趣的是，在这些细胞中，ORP8也被磷酸化，血清饥饿刺激的ORP8磷酸化被AMPK抑制剂Compound C或AMPK α1/α2的KO所逆转。此外，免疫共沉淀检测到ORP8与AMPK之间的相互作用，血清饥饿促进了这种相互作用，Compound C消除了这种相互作用。此外，利用纯化的ORP8和具有激酶活性的AMPK复合物进行体外激酶试验，证实了ORP8是AMPK的直接底物。质谱法分析体外激酶试验中磷酸化的ORP8，发现Thr54和Ser65是AMPK的两个磷酸化位点，Thr54可能更为重要。接下来，作者确定了磷酸化对ORP8介导的脂质自噬的影响，AMPK通过直接磷酸化ORP8促进ORP8与LC3/GABARAP的相互作用，从而激活ORP8介导的噬脂作用。
图3.AMPK磷酸化并激活ORP8
4、ORP8降低小鼠肝脏脂质沉积
最后，作者评估了ORP8介导的ob/ob小鼠噬脂的体内生理效应。作者观察到禁食刺激了小鼠肝脏中ORP8蛋白和mRNA的表达，然后通过腹腔注射表达ORP8-WT、ORP8-T54A/S65A、ORP8-LIRs-6A或ORP5的rAAV9，注射4周后，仅AAV9-ORP8-WT组肝脏TG水平显著降低，并减轻LD在肝脏中的积累。然而，这些注射均未显著降低ob/ob小鼠的血浆TG水平，这可能反映了更复杂的血浆TG调节。 作者还利用CRISPR-Cas9介导的基因组工程构建了ORP8缺失的Osbpl8−/−小鼠。在正常饮食的Osbpl8−/−小鼠中，检测到肝脏LDs和TG水平显著增加；禁食24小时后，这些Osbpl8−/−小鼠表现出明显的脂肪肝表型，肝脏LD进一步积聚，TG进一步升高。综上所述，这些数据表明ORP8在体内LD分解代谢中起着重要作用。 图4.ORP8减轻小鼠的脂质沉积
小结 该研究发现脂质转移蛋白ORP8位于自噬体膜上，并介导自噬体膜对LDs的包裹，ORP8的这一功能独立于其脂质转运蛋白活性，通过与吞噬体锚定的LC3/GABARAPs直接相互作用实现。该研究揭示ORP8是一个在细胞脂质代谢中起关键作用的噬脂受体，在噬脂诱导过程中，ORP8增加了在LD上的定位，并被AMPK磷酸化，从而增强了其对LC3/GABARAPs的亲和性。这些发现对深入理解LD自噬过程及其在细胞脂质代谢中的作用，以及脂肪肝等脂质代谢性疾病的发生机理等有重要意义。 · ·