是干货啊！神经研究中启动子和血清型这样选！

神经系统分为中枢神经系统（Central nervous system, CNS）和外周神经系统（Peripheral nervous system，PNS）。中枢神经系统包括脑和脊髓，分别位于颅腔和椎管内，是神经系统的主要部分，外周神经系统包括与脑相连的脑神经（cranial nerves）和与脊髓相连的脊神经（spinal nerves）。随着研究的深入，人们对神经系统功能已经有了更近一步的认识，但由于神经系统的复杂性、组织再生能力的有限性以及血脑屏障对药物传送的阻隔，使用传统药物和外科手术方法治疗神经系统类疾病仍困难重重。

目前，基因疗法已被应用于多种疾病的治疗，利用病毒载体将遗传物质传递到器官周围，并在靶细胞中实现特异表达，进而实现基因治疗。在神经科学研究中，尤其是在体实验，通常利用腺相关病毒工具载体研究基因的功能作用，那么如何才能更高效地利用AAV在神经系统进行基因转导呢？今天我们就一起学习AAV在神经研究中的选择策略。

据报道，目前适用于神经系统的AAV血清型有：1、2、5、6、8、9、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、DJ、Retro、rh10等十几种，不同的血清型在神经系统不同部位的感染效率及扩散能力不同，合适的血清型关乎基因是否能够实现高效稳定表达，甚至关乎最终的研究结果，因此综合标记的细胞和每种AAV血清型的特性等因素来选择合适的AAV血清型至关重要。根据文献报道，AAV1,2和5在CNS转导水平有限，且表现出不同的细胞特异性，如AAV1和5能转导神经元和胶质细胞，而AAV2只能转导神经元。AAV9在CNS中的应用则较为广泛，具有强的扩散性，且能穿过血脑屏障（BBB）实现基因高表达。而在外周神经系统中，AAV9、rh10、PHP.S的感染效果较好。

常见的AAV病毒载体都是顺向标记，极少能进行逆行传递，这大大限制了AAV载体在神经环路示踪中的应用。直到2016年，研究人员在AAV2的基础上，通过定向进化的方式改造出一种具有逆向示踪功能的AAV2突变体——AAV2-retro，该载体能够在小鼠大脑中进行有效的神经环路逆向标记，且其逆行示踪能力和效率与传统的逆行示踪剂相当。图2所示为rAAV2-retro的开发过程及应用实例：

2017年张砺教授团队研究报道AAV1能在高滴度条件下呈顺向跨突触传播，与Cre依赖的报告系统相结合，可高效和特异性地驱动Cre依赖的外源基因在突触后神经元中的表达，以标记突触后神经元。2020年该研究团队再次深入研究了AAV1顺向跨突触标记的作用机制——依赖于突触囊泡的释放，同时揭示了其在多种神经环路中的广泛应用，为AAV1作为顺向跨突触示踪病毒工具对神经元及其投射脑区进行标记提供了诸多证据，如图3所示。

此外，张砺教授团队还证实scAAV1-hSyn-Cre相比AAV1载体具有更优越的顺向跨突触标记能力，可在兴奋性、抑制性、神经调质和脑-脊髓等多种神经环路中有效、特异地标记单突触靶神经元及其输出，从而解析不同的功能/行为。

血脑屏障的存在对中枢神经系统有很强的保护作用，但同时它也能阻隔药物的传递和吸收，使神经系统疾病的治疗变得异常困难，研究人员通过进一步改造AAV衣壳，发现AAV9& AAVPHP.B&AAVPHP.eB&AAVPHP.S可以有效介导基因由外周向中枢神经系统的跨越，继而将遗传物质递送至大脑或脊髓中。研究结果显示，AAV-PHP.B可以有效地转导成年小鼠大脑和脊髓的神经元，AAV-PHP.eB降低了诱导大多数中枢神经系统神经元所需的病毒载量，而AAV-PHP.S显示出对周围神经元的更好趋向性。总之，这些AAV变体可以有效介导基因由外周向中枢神经系统的跨越，更好地应用于神经环路研究。

美国哈佛大学联合武汉大学人民医院研究团队利用合理性设计的方法，将选定的细胞穿透肽 CPP（一 组可以穿过细胞膜或组织屏障的短肽）分别插入 AAV9 衣壳（Q588 和 A589 之间）生成突变体库， 将包装好的 AAV 突变体通过静脉注射至小鼠体内，经过序列优化和筛选测试，得到血脑屏障穿透性显著优于 AAV9 的 AAV.CPP.16。通过在不同品系小鼠和食蟹猴动物模型中进行验证，发现静脉注射AAV.CPP.16 可以高效跨越血脑屏障，感染 CNS 神经元细胞、星形胶质细胞以及脊髓运动神经元。基于小鼠与食蟹猴研究结果发现，系统给药 AAV.CPP.16 仍可感染肝脏、肌肉、心脏等外周脏器，但在检查的组织中均未观察到明显的病理反应，也未引起背根神经节退化变性。重要的是，研究人员发现AAV.CPP.16 可用于 GBM 小鼠模型的基因治疗，并具有持久高效的抗肿瘤作用。

星形胶质细胞是中枢神经系统损伤的关键反应细胞，在脊髓损伤的发病机制中发挥着重要作用。星形胶质细胞功能障碍已被证实是脑卒中、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病的核心特征。中科院徐富强团队对一系列工具病毒进行改造和筛选，开发了一种新的高效逆行靶向投射神经元的重组腺相关病毒 rAAV11。研究发现，rAAV11 可以高效逆行靶向投射神经元，且不表现出顺行跨突触特征；rAAV11 还具备优秀的逆行标记效率，能示踪 rAAV2 难以转导的投射神经元。值得注意的是，rAAV11 可以高效且特异性靶向星形胶质细胞，为星形胶质细胞的研究提供了更加有力的病毒工具。

北京生命科学研究所罗敏敏实验室通过定向进化策略，开发了一系列能够在体内和体外高效侵染小胶质细胞的新型 rAAV 载体。该研究针对 AAV9 的衣壳蛋白进行改造，鉴定筛选出两个衣壳蛋白（AAV-cMG. WPP 和 AAV-cMG.QRP）能够在一定程度上提高 rAAV 病毒对体外培养的小鼠小胶质细胞的侵染效率。以此为基础，研究团队针对 AAV-cMG.QRP 的插入肽段及其在衣壳蛋白插入位点的相邻氨基酸进行突变筛选，成功得到了高效侵染体外培养小胶质细胞的 AAV-cMG 衣壳蛋白，同时并不导致小胶质细胞的激活。

研究人员进一步在 AAV-cMG.WPP 基础之上构建新的 AAV 突变文库，并在小胶质细胞特异的 Cx3cr1-CreER 转基因小鼠脑内进行针对性体内筛选，成功鉴定得到 AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，能够在体内高效侵染小胶质细胞，且不诱导小胶质细胞免疫激活。