15min不一定能追到一个女朋友,但一定可以完成一次克隆！
——Yeasen Hieff Clone® 一步法克隆试剂盒荣登《Cell》《Science》等国际顶尖期刊
提起“分子克隆”或“载体构建”这两个词，大家可能先想到的是传统酶切酶连法，即用限制性内切酶产生黏性末端，通过T4 DNA连接酶连接两个片段的克隆方法。该方法存在着一些明显的局限，如连接反应时间长，操作繁琐，克隆效率低，酶切位点的选择易受到限制等。
为了提高克隆效率，节省反应时间，基于同源重组酶的无缝克隆技术应用而生。与传统酶切酶连技术相比，无缝克隆技术操作简单快速，不受到酶切位点的限制，可一次进行多个片段的拼接，大大的提高了克隆效率。
翌圣生物在成熟的工具酶表达纯化平台基础上，获得高纯度重组酶，并反复优化重组酶反应微环境，研发出Hieff Clone®系列无缝克隆试剂盒。
Hieff Clone®克隆试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5'端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5'和3'末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，最快仅需反应5分钟即可用于后续转化，完成定向克隆，克隆阳性率可达95%以上。
产品优势
● 无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
● 设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
● 快速高效：50℃，最快5分钟即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
● 应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，高效克隆50 bp-10 kb片段；也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
实验操作流程
①线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体
②插入片段的制备：在目的DN**段上下游引物的5'端引入15-25 bp左右载体末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。
③重组反应：按比例混合线性化载体和目的DN**段进行重组，50℃反应5-20 min。
④转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板，阳性克隆鉴定。
图1：Hieff Clone®一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。
实验数据
★单片段高效重组（Cat# 10911）
图2：Hieff Clone® One Step Cloning Kit（Cat# 10911）可以有效克隆不同长度的单片段基因。
A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。
★多片段轻松重组（Cat# 10912）
图3：Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit（Cat# 10912）进行三片段克隆。
A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重组反应条件：50℃，20 min。
★单片段、五片段高效重组（Cat# 10922）
图4：Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit（Cat# 10922）可保证单片段、多片段高效克隆。
A-B：重组转化平板。C：插入片段PCR鉴定电泳图。载体：pGEX4T-1, 5 kb，插入片段长度：2 kb，摩尔比为1:3，重组反应条件：50℃，5 min。E-F：重组转化平板。G：插入片段PCR鉴定电泳图。载体：pGEX4T-1, 5 kb，五个插入片段：0.5 kb， 0.5 kb，0.5 kb，0.5 kb和1 kb，重组反应条件：50℃，30 min。
客户反馈
◆ 长片段重组
实验信息：载体大小：8000 bp，目的片段大小：7500 bp。
实验数据：
图5：使用Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit进行克隆。
A：阴性对照转化平板。B：重组质粒转化平板。C：载体和目的片段的浓度检测电泳图。D：菌落PCR鉴定电泳图，箭头指示目的条带。 M1：Marker Ⅲ；M2：100 bp DNA ladder。(仁济医院)
◆ 多片段重组
实验信息：载体大小：3996 bp；四个片段大小：576 bp，867 bp，915 bp和647 bp。
实验数据：
图6：使用Hieff Clone® Multi One Step Cloning Kit进行克隆。
A：重组质粒转化平板。B：1为载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图。C：菌落PCR验证结果，其中1为原始质粒对照电泳，2-5为重组质粒，仅检测863bp的一个目的片段，6为假阳性。D：阳性克隆测序结果。M：Marker II。（微生物所)
FAQ
Q：Hieff Clone®克隆的原理是什么？
A：利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DN**段快速定向克隆。
Q：与传统克隆相比，Hieff Clone®克隆有什么优势？
A： 1）无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
2）设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5'端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
3）快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
4）应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
Q：同源序列长度对重组效率的影响？
A：同源序列的长度与克隆数目有相关性，一般同源片段选择在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。
Q：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？
A：线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，建议割胶回收纯化产物。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？
A：推荐使用转化效率为108 cfu/μg的感受态细胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。
Q：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？
A：载体使用量应大于0.01 pmol，推荐使用量0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内，最适为1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些？
A：本试剂盒适用于绝大多数基于常规“酶切-连接”方法的克隆实验，并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。
Q：多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗？
A：多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是，单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆，重组效率可能会受到影响。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃，是否可以在37℃进行反应？
A：一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构，同时是Hieff Clone®重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应，请根据实验需要进行优化。
部分发表文献
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